聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的电泳方法。
在这种支持介质上可根
据被分离物质分子大小和分子电荷多少来分离。
聚丙烯酰胺凝胶有以下优点：
①
聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺和
N
，
N'
甲叉双丙烯酰胺聚合而成的大分子。凝胶有
格子是带有酰胺侧链的碳
-
碳聚合物，没有或很少带有离子的侧基，因而电渗作用比较小，
不易和样品相互作用。
②
由于聚丙烯酰胺凝胶是一种人工合成的物质，在聚合前可调节单体的浓度比，形成
不同程度交链结构，其空隙度可在一个较广的范围内变化，可以根据要分离物质分子
的大小，选择合适的凝胶成分，使之既有适宜的空隙度，又有比较好的机械性质。一
般说来，含丙烯酰胺
7-7.5%
的凝胶，机械性能适用于分离分子量范围不
1
万至
100
万物
质，
1
万以下的蛋白质则采用含丙烯酰胺
15-30%
的凝胶，而分子量特别大的可采用含
丙烯酰胺
4%
的凝胶，
大孔胶易碎，
小孔胶则难从管中取出，
因此当丙烯酰胺的浓度增
加时
可以减少双含丙烯酰胺，以改进凝胶的机械性能。
③
在一定浓度范围聚丙烯酰胺对热稳定。凝胶无色透明，易观察，可用检测仪直接测定。
④
丙烯酰胺是比较纯的化合物，可以精制，减少污染。合成聚丙烯酰胺凝胶的原料是丙烯酰
胺和甲撑双丙烯酰胺。丙烯酰胺称单体，甲撑双
丙烯酰胺称交联剂，在水溶液中，单体和交联剂通过自由基引发的聚合反应形成凝
胶。
在聚丙烯酰胺凝胶形成的反应过程中，需要有催化剂参加，催化剂包括引发剂和
另速剂两部分。引发剂在凝胶形成中提供始自由基，通过自由基的传递，使丙烯酰胺
成为自由基，发动聚合反应，加速剂则可加快引发剂放自由基的速度。常用的引发剂
和加
速剂的配伍如下表：
聚合反应催化剂配伍
引
发
剂
加
速
剂
（
NH4)2S2O8 TEMED
(NH4)2S2O8DMAPN
核
黄
素
TEMED
注：
(NH4)2S2O8
，过硫酸胺
TEMED
：
N
，
N
，
N
，
N';
四甲基乙二胺
DMAPN
：
β
－二甲基
胺基丙晴
用过硫酸铵引发的反应称化学聚合反应；用核黄素引发，需要强光照射反应液，
称光聚合
反应。
聚丙烯酰胺聚合反应可受下列因素影响：
聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的电泳方法。
在这种支持介质上可根
据被分离物质分子大小和分子电荷多少来分离。
聚丙烯酰胺凝胶有以下优点：
①
聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺和
N
，
N'
甲叉双丙烯酰胺聚合而成的大分子。凝胶有
格子是带有酰胺侧链的碳
-
碳聚合物，没有或很少带有离子的侧基，因而电渗作用比较小，
不易和样品相互作用。
②
由于聚丙烯酰胺凝胶是一种人工合成的物质，在聚合前可调节单体的浓度比，形成
不同程度交链结构，其空隙度可在一个较广的范围内变化，可以根据要分离物质分子
的大小，选择合适的凝胶成分，使之既有适宜的空隙度，又有比较好的机械性质。一
般说来，含丙烯酰胺
7-7.5%
的凝胶，机械性能适用于分离分子量范围不
1
万至
100
万物
质，
1
万以下的蛋白质则采用含丙烯酰胺
15-30%
的凝胶，而分子量特别大的可采用含
丙烯酰胺
4%
的凝胶，
大孔胶易碎，
小孔胶则难从管中取出，
因此当丙烯酰胺的浓度增
加时
可以减少双含丙烯酰胺，以改进凝胶的机械性能。
③
在一定浓度范围聚丙烯酰胺对热稳定。凝胶无色透明，易观察，可用检测仪直接测定。
④
丙烯酰胺是比较纯的化合物，可以精制，减少污染。合成聚丙烯酰胺凝胶的原料是丙烯酰
胺和甲撑双丙烯酰胺。丙烯酰胺称单体，甲撑双
丙烯酰胺称交联剂，在水溶液中，单体和交联剂通过自由基引发的聚合反应形成凝
胶。
在聚丙烯酰胺凝胶形成的反应过程中，需要有催化剂参加，催化剂包括引发剂和
另速剂两部分。引发剂在凝胶形成中提供始自由基，通过自由基的传递，使丙烯酰胺
成为自由基，发动聚合反应，加速剂则可加快引发剂放自由基的速度。常用的引发剂
和加
速剂的配伍如下表：
聚合反应催化剂配伍
引
发
剂
加
速
剂
（
NH4)2S2O8 TEMED
(NH4)2S2O8DMAPN
核
黄
素
TEMED
注：
(NH4)2S2O8
，过硫酸胺
TEMED
：
N
，
N
，
N
，
N';
四甲基乙二胺
DMAPN
：
β
－二甲基
胺基丙晴
用过硫酸铵引发的反应称化学聚合反应；用核黄素引发，需要强光照射反应液，
称光聚合
反应。
聚丙烯酰胺聚合反应可受下列因素影响：
核
黄
素
TEMED
核
黄
素
TEMED
以下为东营光正化工有限责任公司为大家整理的聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作步骤~
1、安装夹心式垂直板电泳槽：夹心式垂直板电泳槽两侧为有机玻璃制成的电极槽，两电极槽中间有一凝胶模，该模由ㄩ形硅胶框，长、短玻璃板，模板梳组成，电泳槽由上贮槽(白金电极面对短玻璃板)，下贮槽(白金电极面对长玻璃板)和回纹冷凝管组成，两电极槽与凝胶模间靠贮液槽螺丝固定，其组装顺序为：
①装贮槽和固定螺丝销钉；
②将洗净的长、短玻璃板分别插到ㄩ形硅橡胶框的凹形槽中，注意不要用手接触灌胶面的玻璃；
③将已插好玻板的凝胶模夹到贮槽中，短玻璃板应面对上贮槽，长玻璃板应面对下贮槽，双手以对角线的方式旋紧螺丝帽；
④竖直电泳槽，用滴管吸取少量的1%琼脂糖溶液，灌入凝胶模板底部(长玻璃板外侧，下沿凹形小槽内)，液面高度约0.5～1.0cm,待琼脂糖凝固后,即堵住凝胶模下面的窄缝(通电时又可作为盐桥)。
2、配胶：根据所测蛋白质分子量范围，选择适宜的分离胶浓度。
3．制备凝胶板：
（1）分离胶制备：按表配制20ml 10%分离胶，混匀后用细长头滴管将凝胶液加至长、短玻璃板间的缝隙内，约8cm高，用1ml注射器取少许蒸馏水，沿长玻璃板板壁缓慢注入，约3—4mm高，以进行水封。约30min后，凝胶与水封层间出现折射率不同的界线，则表示凝胶完全聚合。倾去水封层的蒸馏水，再用滤纸条吸去多余水分。
（2）浓缩胶的制备：按表配制10ml 3%浓缩胶，混匀后用细长头滴管将浓缩胶加到已聚合的分离胶上方，直至距离短玻璃板上缘约0.5cm处，轻轻将样品槽模板插入浓缩胶内，避免带入气泡。约30min后凝胶聚合，再放置20—30min。待凝胶凝固，小心拔去样品槽模板，用窄条滤纸吸去样品凹槽中多余的水分，将pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液倒入上、下贮槽中，应没过短板约0.5cm以上，即可准备加样。
n4．加样
一般加样体积为10－15μL（即2－10μg蛋白质）。如样品较稀，可增加加样体积。用微量注射器小心将样品通过缓冲液加到凝胶凹形样品槽底部，待所有凹形样品槽内都加了样品，即可开始电泳。
n5．电泳
加样毕，在上槽加入0.1%溴酚蓝数滴，不要移动电泳槽(防引起样品漂流)，接通电源，先低压电泳一般时间，待指示剂在胶板上成一条直线时，即可将电泳槽移入冰箱，按所需电流电压进行电泳。温度控制在0～4℃。由于电流和电压同电极缓冲液的离子强度有关，因此根据电极缓冲液分高离子强度和低离子强度两种。高离子强度电极缓冲液配方：141.1g甘氨酸加30g Tris加水1000ml，用时稀释20倍调PH值至8.3；低离子强度电极缓冲液配方：2g甘氨酸加5.2g Tris加水至1000ml，用时衡释10倍，调PH值至8.7。
当电极缓冲液离子强度确定后，又有稳定电流和稳定电压两种电泳方式。用高离子强度电泳液，稳定电流2.0～2.5mA/cm，电泳16小时左右；用低离子强度电泳液，稳定电流0.2～0.3mA/cm，电泳16小时左右，此为稳定电流的方法。稳定电压电泳方式通常是这样：用高离子强度时，稳定电压10V/cm，电泳14～15小时；用低离子强度时，稳定电压20V/cm，约4～5小时。若指示剂移动到离下层电泳液水平面1cm处，即可关闭电源，停止电泳。
6、卸板
电泳完毕，从冰箱中取出电泳槽，吸出电极缓冲液，将胶板从电泳槽上卸下，平放在实验台上，用压舌板在两块玻璃板的一角轻轻一撬，揭去上面长型玻璃板。用刀片在胶板一端切除一角作为标记，而后用磨平针尖的兽医用针头吸取无离子水把凝胶从短型玻璃板上剥离，慢慢地把胶板冲入白瓷盘或大培养皿内，即可染色与固定。
7、固定与染色
为防止凝胶柱内已分离成分的扩散，需要进行固定。剥出的凝胶柱只要浸泡在7%乙酸或12.5%三氯乙酸的水溶液中几分钟就可达到蛋白带固定的效果。也可浸泡在用7%乙酸或12.5%三氯乙酸配制的染色液中，同时进行固定和染色。如果用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离和鉴定同工酶，为了让酶带上进行某种显色反应，往往是先显色后固定。
8、SOD鉴定
① SOD的活性染色：参照 Beauchamp 和 Fridoch 方法, 在黑暗中将电泳后的凝胶片浸泡于 2. 45×103mol/ L 氮蓝四唑( NBT) 20min, 然后, 将凝胶片移入到含有 0. 028 mol/ L 四甲基乙二胺( TEMED) , 2. 8×10- 5mol/ L 核黄素和0. 036 mol/ L 磷酸缓冲液中( pH7. 8) , 浸泡 15 min. 最后将胶片浸泡在含有 0. 05 mol/ L 磷酸缓冲液中( pH7. 8) , 1×10- 4mol/ L EDTA 溶液, 并用 4×8W 日光灯照 20min 显带, 蒸馏水漂洗后即可照相.
② 蛋白质的常染色法：
考马斯亮兰G250
固定液
染料
染色时间
脱色
6%乙酸
6%乙酸中1%G250
10分钟(室温)
甲醇-水-浓氨
12.5%三氯乙酸
12.5%三氯乙酸中0.1%G250
30分钟(室温)
64:36:1
希望上述内容对您有一定的帮助，如果您想了解更多关于聚丙烯酰胺的知识，欢迎继续关注本站。
